秦皮为木犀科植物苦枥白蜡树FraxinusrhynchophyllaHance、白蜡树F.chinensisRoxb.、尖叶白蜡树F.szaboanaLingelsh.或宿柱白蜡树F.stylosaLingelsh.的干燥枝皮或干皮，主产于陕西，春秋2季采收[1]，尤以3～4年生的干皮药材质量为好。秦皮为清热燥湿药，传统用于治疗湿热泻痢、目赤肿痛等症，其主要成分为香豆素类化合物，如秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素等，具有抗菌、抗炎、保肝等作用[2-6]。

秦皮饮片的传统炮制方法为除去杂质，洗净，润透，切丝，干燥（《中国药典》年版）。而目前市场上的秦皮饮片多存在不去粗皮或粗皮去不净的现象，严重影响秦皮的临床疗效和调剂时的剂量准确性。这是因为皮类药材市场上多以面积大小来评价药材等级[7]，由于秦皮药材价格便宜，且采收费时费力，导致药农在采收时只采生长年限长（尤其5年以上[8]）的树皮，虽然这些树皮面积大，但是纤维性很强、栓皮部位很厚。这样的树皮在饮片厂即使反复闷润也很难刮去粗皮，因此很多饮片厂生产的秦皮不去粗皮，这样不仅难以保证有效部位的含量，且干燥后秦皮丝经常出现韧皮部与栓皮部分离的现象，既不美观，也容易掉渣。且秦皮药材长时间反复闷润，由于秦皮甲素等香豆素类成分可溶于水，容易导致此类有效成分的流失。

为提高秦皮药材中有效成分的利用率，便于去除粗皮，可将秦皮的产地加工与炮制生产工艺进行整合，以采收后产地直接趁鲜刮去粗皮、切制干燥的方法制备秦皮产地加工与炮制生产一体化饮片。已有学者对秦皮进行了产地加工与饮片炮制一体化技术研究[9]，但文章报道的一体化工艺秦皮饮片是在老药工的经验指导下生产的，且只报道了化学成分的变化，没有对其药理作用进行研究。因此本研究以秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷和总香豆素含量的总评归一值为评价指标，采用星点设计-效应面法[10-12]优选秦皮产地加工与炮制一体化工艺；在此基础上研究秦皮的抗炎镇痛作用。以期为秦皮的一体化生产提供科学依据。

1材料

1.1仪器

UltiMateTM型反相高效液相色谱仪，配LPGA低压四元梯度泵、PDA二极管阵列检测器、Chromeleon工作站、UTCC-SD标准柱温箱，美国戴安公司；AR型电子天平，万分之一，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DZF-真空干燥箱，上海欣齐科学仪器有限公司；KH--KDE型高功率数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；QE-g粉碎机，浙江屹立工贸有限公司；iMark酶标仪，美国Bio-Rad公司；PV-足肿胀测定仪，成都泰盟科技有限公司。

1.2动物

SPF级雄性KM小鼠，体质量18～22g；SPF级雄性SD大鼠，体质量～g，购自西安交通大学医学部实验动物中心，动物合格证号SCXK（陕）-。

1.3试药

秦皮药材于年7月采自陕西省宝鸡市，由陕西中医药大学药学院王昌利教授鉴定为木犀科植物宿柱白蜡树FraxinusstylosaLingelsh.的干燥干皮，凭证标本（YP-）保存于陕西中医药大学炮制教研室。对照品秦皮甲素（批号-104）、秦皮乙素（批号-607）、秦皮素（批号-501）购于中国食品药品检定研究院，对照品秦皮苷（批号）购自西玛实验室，HPLC测定各对照品质量分数均≥98%；戊巴比妥钠，中国医药（集团）上海化学试剂公司，批号F90417；甲醇、磷酸、冰醋酸均为分析纯，成都市科龙化工有限公司；乙腈为色谱纯，赛默飞世尔中国有限公司；水为娃哈哈纯净水；λ型角叉菜胶，美国Sigma公司，批号-5G-F。

2方法与结果

2.1总香豆素含量测定[13-15]

2.1.1对照品溶液的制备精密称取秦皮甲素对照品，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.33mg/mL的对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备称取秦皮药材粉末1g（过3号筛），精密称定，置具塞圆底烧瓶中，再精密加入50mL甲醇，称定质量，加热回流1h，放冷，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，即得。

2.1.3最大吸收波长的确定以甲醇溶液作为空白对照，分别将上述对照品和样品溶液在紫外分光光度计进行全波长扫描，结果对照品和样品均在nm处有最大吸收，故选择检测波长nm。

2.1.4线性关系考察精密量取“2.1.1”项下秦皮甲素对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，以甲醇为空白，在nm波长处测定吸光度（A），以A值为纵坐标，秦皮甲素的质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A＝0.C＋0.，r＝0.，表明秦皮甲素在6.6～33.0μg/mL线性关系良好。

2.1.5精密度试验取同一对照品溶液，以甲醇为空白对照，在nm波长处测定A值，重复测定6次，RSD为0.42%，表明本方法精密度良好。

2.1.6稳定性试验取同一供试品溶液，以甲醇为空白对照，分别在0、2、4、6、8h时间点，在nm波长处测定A值，RSD为1.21%，结果表明供试品溶液在8h内基本稳定。

2.1.7重复性试验取同一样品6份，每份1g，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，以甲醇为空白对照，在nm波长处测定A值，RSD为1.36%，表明本方法重复性良好。

2.1.8加样回收率试验取已测定总香豆素含量的样品6份，每份0.5g，分别加入一定量秦皮甲素对照品溶液，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，以甲醇为空白对照，在nm波长处测定A值，结果平均回收率为97.42%，RSD为2.16%，结果表明本方法回收率良好。

2.24种主要香豆素含量测定[16]

2.2.1色谱条件色谱柱为BetasilC18柱（mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（12∶88）；检测波长nm；柱温30℃；体积流量1mL/min；进样量10μL。理论塔板数按秦皮乙素峰计算应不低于。

2.2.2对照品溶液的制备分别精密称取秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷对照品适量，加甲醇溶解并配制成含秦皮甲素0.33mg/mL、秦皮苷0.13mg/mL、秦皮乙素0.21mg/mL、秦皮素0.16mg/mL的混合对照品溶液，混匀备用。

2.2.3供试品溶液的制备取秦皮样品粉末约0.5g（过3号筛），精密称定，置具塞圆底烧瓶中，再精密加入50mL甲醇，密塞，称定总质量，加热回流1h，放冷，再称定总质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.2.4专属性考察按“2.2.1”项下色谱条件测定空白甲醇溶液、混合对照品溶液和供试品溶液，色谱图见图1，结果显示，各组分分离度好，无干扰。

2.2.5线性关系的考察按“2.2.1”项下色谱条件进行，测定进样量分别为5、8、11、14、17、20μL的混合对照品溶液中4个香豆素峰面积，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），建立标准曲线，计算回归方程，分别为秦皮甲素Y＝52.X＋1.，r＝0.，在1.65～6.6μg与峰面积呈良好的线性关系；秦皮苷Y＝44.X＋0.，r＝0.，在0.65～2.6μg与峰面积呈良好的线性关系；秦皮乙素Y＝37.X－3.，r＝0.，在1.05～4.2μg与峰面积呈良好的线性关系；秦皮素Y＝16.X＋0.，r＝0.，在0.9～3.2μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6精密度试验按“2.2.1”项下色谱条件，连续进样测定混合对照品6次，记录峰面积，计算秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素峰面积RSD分别为0.21%、0.52%、0.37%、0.44%，结果表明本法精密性良好。

2.2.7稳定性试验按“2.2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12h时进样测定同一供试品溶液的峰面积，记录峰面积，计算秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素峰面积RSD分别为1.32%、1.62%、0.89%、2.04%，结果表明供试品溶液在12h内基本稳定。

2.2.8重复性试验取同一样品6份，每份0.5g，按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素峰面积RSD分别为1.44%、1.78%、1.62%、1.93%，表明本方法重复性良好。

2.2.9加样回收率试验取已测定4种香豆素含量样品6份，每份0.25g，分别加入一定量秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素对照品溶液，按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积。结果秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素的平均回收率分别为.42%、99.32%、98.21%、96.83%，RSD分别为1.66%、1.45%、1.73%、2.02%，结果表明本方法回收率良好。

2.3秦皮的炮制

2.3.1传统饮片取新鲜秦皮药材，室外自然晒干，快速淋洗去除附着杂质，加水闷润至内外水分一致，刮去粗皮，切宽丝，恒温烘箱中干燥。

2.3.2一体化加工饮片取新鲜秦皮药材，趁鲜刮去粗皮，快速淋洗去除附着杂质，切宽丝，恒温烘箱中干燥。

2.4单因素实验

2.4.1切丝规格《中国药典》年版四部炮制通则规定饮片切丝的范围为2～10mm，其中2～3mm为细丝，5～10mm为宽丝。药典对秦皮丝切丝范围没有明确规定为细丝或宽丝，而《陕西省中药饮片标准》规定秦皮丝宽3～5mm，介于细丝与宽丝中间，因此本实验选择2、4、6、8、10mm5个规格进行考察，取秦皮鲜药材适量，刮去粗皮，抢水洗净杂质，分别切制为约2、4mm的细丝及约6、8、10mm的宽丝，60℃干燥至水分达标。考察不同切制规格对秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷和总香豆素的总评归一值[17]［overalldesirabilityvalue，OD值，利用Hassan法对各效应值进行归一化，本次实验的效应值为有效成分的含量，含量越高越好，因此，归一值di＝(yi－ymin)/(ymax－ymin)，再对归一值求几何平均值，OD＝(d1，d2，…，dn)1/n］的影响，OD值分别为0.、0.、0.、0.、0.。随着切制规格的增加，OD值呈现降低的趋势，但是2mm和4mm的细丝在干燥后出现分层的现象，因此选择6、10mm为后续优化实验的最低、最高水平。

2.4.2干燥温度取秦皮鲜药材适量，刮去粗皮，抢水洗净杂质，切6mm的宽丝，分别在30、45、60、75、90℃干燥至水分达标。考察不同干燥温度对秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷和总香豆素的OD值的影响，OD值分别为0.、0.、0.、1.、0.。随着干燥温度的增加，OD值呈现先增大再减小的趋势，因此选择30、75℃为后续优化实验的最低、最高水平。

2.4.3干燥时间取秦皮鲜药材适量，刮去粗皮，抢水洗净杂质，切6mm的宽丝，分别在75℃干燥1、2、3、4、5h。考察不同干燥时间对秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷和总香豆素OD值的影响，OD值分别为0.、0.、0.、0.、0.。随着干燥时间的增加，OD值呈现逐渐增大的趋势，但是1h的样品水分为18.86%，不符合要求，因此选择2、5h为后续优化实验的最低、最高水平。

2.5响应面优化秦皮一体化炮制工艺

2.5.1试验设计及结果根据单因素对可能影响秦皮饮片质量的产地加工与炮制一体化技术中的工艺因素考察，选取了切制规格（X1）、干燥温度（X2）、干燥时间（X3）3个考察因素，每个因素选取了3个水平，以秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷和总香豆素的OD值为响应值，形成3因素3水平星点设计试验对秦皮饮片的一体化最佳工艺进行优化确定。采用Design-Expert8.05b软件的星点设计方案安排17组秦皮一体化炮制工艺条件，因素水平、试验安排及结果见表1。

2.5.2方差分析及数据处理以秦皮中所含成分的总评值为因变量，对切制规格、干燥温度、干燥时间各因素进行二项式拟合，得到二项式拟合的复相关系数r2＝0.，模型P＜0.，具有较高显著性，说明拟合的模型能够进行秦皮产地加工炮制一体化工艺的分析和预测。由方差分析（表2）可以看出，3个因素的1次项、2次项都具有显著性差异，说明各个具体试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。因此，选择二项式拟合模型。二项式拟合方程为OD＝0.67－0.11X1＋0.12X2＋0.X3－8.×10?3X1X2＋0.X1X3－0.X2X3－0.X12－0.X22－0.X32。

由表2可知，切制规格和干燥温度对秦皮有效成分的归一值影响最大（P＜0.1），干燥时间也有极显著影响（P＜0.01）。回归方程失拟性检验P＝0.＞0.05，无显著性差异，说明模型拟合度良好；二项式模型P＜0.1，达极显著水平，说明该方程与实际情况拟合良好，模型的残差可能是随机误差产生，可用此模型和方程来分析预测最佳炮制一体化工艺条件，秦皮有效成分的OD值与任意2个因素的三维效应面曲线见图2。以秦皮有效成分的OD值最大为目标，根据DesignExpert8.05b实验设计软件得秦皮一体化炮制工艺最优参数为切6mm，干燥温度75℃，干燥时间3.23h，OD预测最大值为0.。

2.6验证试验

根据“2.5.2”优选出的最佳工艺及实际操作条件调整为秦皮鲜药材刮去粗皮，洗净杂质，切6mm宽丝，干燥温度75℃，干燥时间3.25h，制备3批样品，测定各指标成分含量，结果见表3。由表3中最佳一体化工艺所得的秦皮的含量测定结果可见，有效成分总含量的实际值与预测值相比较，偏差都较小，表明本实验所建立的数学模型准确可靠，优化出的一体化最佳工艺重现性好。与传统加工的秦皮饮片比较，一体化炮制品中4种有效成分和总香豆素含量均较高，除了传统饮片水处理的时候会造成损失外，传统秦皮饮片残留的部分栓皮也导致整个秦皮饮片的含量较低。以上结果表明该最佳工艺切实可行，可操作性强。

2.7一体化工艺与传统工艺饮片药效的比较

2.7.1对大鼠的抗炎作用雄性SD大鼠30只，分为3组，依次为模型组、一体化加工秦皮组、传统秦皮饮片组，2组秦皮饮片组大鼠ig7.2g/kg提取物（按生药量算）[18]，模型组大鼠ig10mL/kg生理盐水，每天1次，连续7d。末次给药结束1h后，各组分别在大鼠右足趾部sc1%角叉菜胶溶液0.1mL致炎[19]，标记右足测量部位，分别在致炎前与致炎后1、2、3、4、5h测量右足厚度，参考文献方法计算大鼠足肿胀度（足肿胀度＝致炎后足厚度－致炎前足厚度）[20]。

一体化秦皮饮片和传统秦皮饮片对炎症模型大鼠足肿胀程度的结果见表4，由结果可知一体化秦皮饮片和传统秦皮饮片均能明显减轻角叉菜胶引起的小鼠足趾肿胀，显示出较好的抗急性炎症作用，尤其一体化秦皮饮片较传统秦皮饮片抑制肿胀作用更加明显，但是两者之间无显著性差异，其5h肿胀抑制率可达26.3%。

2.7.2对小鼠的镇痛作用雄性KM小鼠30只，分为3组，依次为模型组、传统秦皮饮片组、一体化加工秦皮组，2组秦皮饮片组大鼠ig7.2g/kg提取物，模型组大鼠ig10mL/kg生理盐水，每天1次，连续7d。末次给药结束后30min，每只小鼠均ip0.7%冰醋酸0.2mL。注射完毕后立即计时，记录小鼠出现扭体反应的潜伏期及15min内的扭体次数，并计算药物对小鼠扭体反应的抑制率。

一体化秦皮饮片和传统秦皮饮片对小鼠扭体反应的抑制率结果见表5，由结果可知一体化秦皮饮片和传统秦皮饮片均能明显延长小鼠扭体反应的潜伏期，减少扭体次数，显示出较好的镇痛作用，尤其一体化秦皮饮片较传统秦皮饮片镇痛作用更加明显，且镇痛率两者之间具有显著性差异（P＜0.05），其镇痛率可达22.4%。

3讨论

在单因素试验的基础上，本实验采用多指标归一化评分法对秦皮的产地加工与炮制一体化工艺进行优选，结果表明方差分析及综合评分的结果具有一致性，确定了秦皮的最佳一体化工艺；一体化加工的秦皮饮片与传统加工秦皮饮片在香豆素类成分的定量分析结果显示，一体化工艺优于传统加工工艺，与传统秦皮加工的水处理导致成分流失和栓皮等非药用部位难以处理有关。

对角叉菜胶致大鼠足肿胀模型以及醋酸引起的小鼠疼痛模型的影响结果表明，一体化工艺与传统工艺均有一定的抗炎症镇痛效果，且一体化工艺所得饮片效果优于传统工艺组。有研究表明，秦皮香豆素类成分（尤其是秦皮甲素）具有消炎、镇痛的功效[21-24]，药理实验结果与成分定量测定结果具有一致性，但是秦皮香豆素类成分抗炎镇痛的具体机制需要进一步研究。

综上所述，秦皮加工一体化工艺与传统工艺相比，在化学成分含量方面，药典规定的指标成分以一体化工艺更好；药效方面，2种加工工艺均有一定抗炎镇痛作用，且以一体化工艺所得饮片作用较优，但两者功效无显著性差异。同时一体化工艺相对传统工艺，缩短了加工周期，同时解决了饮片传统生产方式中原料药材软化时间长且软化程度不一致导致饮片质量不稳定的问题，以及晒干药材粗皮难以去处的问题，为秦皮饮片生产模式的变革提供借鉴。

参考文献（略）

来源：赵重博，王晶，吴建华，邹俊波，李晓尧，史亚军，王昌利.响应面法优化秦皮产地加工与饮片炮制一体化工艺研究[J].中草药,,49(20):-.

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